【关注】Cell Research 报道 NgAgo 有效！但韩春雨的实验还是不可重复

NgAgo 又搞事情了。

11月11日，Nature 旗下生命科学期刊 Cell Reseach 在线刊登了中国南通大学神经再生重点实验室副教授刘东团队关于 NgAgo 研究的最新成果——他们发现 NgAgo 系统确实有效！在这篇题为 NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish 的 Letter to the editor 中，研究者观察到，NgAgo 确实可以改变斑马鱼的表型，但这并非是通过基因编辑实现的。事实上，团队通过实验得出结论，NgAgo 系统可以在不改变目标基因序列的情况下，对基因表达实现 knockdown（即下调其目标 mRNA 表达水平），且这可能与 NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

文章作者同时强调，他们没有在斑马鱼中观察到 NgAgo 系统的基因编辑功能。

所以，曾经的“基因编辑工具”

真正作用是 knockdown ？！

我们这里先简单介绍一下以上的几个结论是怎么做出来的（您可以点击阅读原文跳转到论文原文。这篇文章是 open 的）。

首先，NgAgo 可以改变斑马鱼的表型，但与基因编辑无关

研究者选择了斑马鱼中一个名叫 fabp11a 的基因作为 NgAgo 的“调控”对象。这个基因可以编码一种脂肪酸结合蛋白，可以调节葡萄糖及脂质的稳态，还有炎症反应。除了试试 NgAgo，研究者还想看看 fabp11a 在斑马鱼胚胎发育过程的作用，于是，他们将编码 NgAgo 的 mRNA 和设计好的 5’-磷酸化单链 DNA 一起注射到了单细胞时期的斑马鱼胚胎中。

为了确保注射的 NgAgo mRNA 能够进入细胞核表达 NgAgo 蛋白，研究者专门在 mRNA 的两端增加了细胞核的定位序列（NLS）；而 5’-磷酸化单链 DNA 专门靶向 fabp11a 的第二和第三个外显子——如果 NgAgo 能编辑基因，这两段基因序列将会被改变。

实验结果是：NgAgo 的存在，使 30% 的斑马鱼胚胎在发育后出现了眼部畸形，但这不是基因编辑的结果（*3）！

测序发现，fabp11a 的基因没有发生任何变化，反倒是 fabp11a mRNA 的相对表达量下降了约50%。

fabp11a 没有被编辑，但被 knockdown 了。

其次，NgAgo 的 knockdown 作用在斑马鱼中存在普遍性。

NgAgo 对 fabp11a mRNA 表达的下调是一个意外吗？为了验证这一点，研究人员又对斑马鱼中的其他四个基因进行的测试，结果发现，在靶向 ta、kdrl、 lama1 和 flt1 这4个基因时，NgAgo 都能实现 knockdown 作用，并且改变基因所对应的表型。

NgAgo 的 knockdown 作用是具有普遍性的。

最后，作者没有在 NgAgo 中重复出基因编辑功能

河北科技大学教授韩春雨此前在《自然-生物技术》上发表的文章显示，NgAgo 系统可以在 37°C 的条件下对人细胞进行基因编辑，编辑效率为 11.2%-41.3%。研究者在确保半数以上的实验斑马鱼胚胎能正常发育的条件下，将实验温度设定为 37°C。然而结果显示，NgAgo 系统在这一条件下仍没有表现出任何基因编辑活性——尽管 knockdown 效应仍然存在。

有趣的是，当研究者将 NgAgo 中两个天冬氨酸位点进行突变 —— 有研究预测，这两个位点与 NgAgo 的基因剪切催化活性有关，并没有对实验中出现的 knockdown 效应产生影响。 这说明，研究者观察到的 knockdown 效应可能与NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

最后，研究者以这样一句话结束了本篇文章：

……we hypothesize that gDNA/NgAgo may bind to a target gene to block its transcription. Overall, we suggest that the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene knockdown in zebrafish.

我们提出一种假设，即 gDNA/NgAgo 的作用可能是结合目标基因，从而阻碍基因的转录。总的说来，我们认为 gDNA/NgAgo 为斑马鱼中的基因knockdown 提供了一种替代方案。

为斑马鱼中的基因 knockdown 提供了一种替代方案。

文章的通讯作者刘东博士对该项该项研究的说明（微信采访）：我们的研究是在斑马鱼模型上做的，我们没有发现indels，但是可以抑制基因表达，推测是结合到了DNA上，阻止了转录。并没有支持或者反驳韩教授的结果。实际上这个研究是我们意外的一个小发现。

刘东博士课题组合影（图片由刘东博士提供）

文章共同作者之一王永明研究员对该项工作的介绍和点评（微信语音采访）：这个工作大约在韩春雨NBT文章发表后一个月开始着手的，然后前后大约做了5个月，最初的想法是运用这个新技术在斑马鱼里对自己感兴趣的基因实行基因编辑，看看效果怎样，但是并没有想到是如今论文报道的这个结果。在斑马鱼里以前主要是用morpholino的手段敲低基因表达，但是这个文章告诉我们gDNA/NgAgo系统也能实现目的基因的敲低并且效率上也有一定优势，所以这个工作对于在斑马鱼里敲低基因表达还是十分有意义的。

温州医科大学谷峰教授（13位实名呼吁对韩春雨启动调查的学者之一）对该项工作的点评和疑问：

本研究原预期目的是希望能够在模式生物斑马鱼上利用韩春雨的研究工具（发表在NBT杂志）来研究一个未知基因功能，具体是试图利用NgAgo工具去解析Fabp11a基因在斑马鱼发育中作用，但是并没有获得类似韩春雨在人类细胞中基因编辑的结果（对应的靶基因序列产生In/del）。但是仍然发现少量斑马鱼有表型，在此基础上，通过进一步研究发现，NgAgo/5'p-gDNA系统可能具有基因表达调节的功能，也就是NgAgo/5'p-gDNA通过knock-down去调节Fabp11a基因的功能。该结果在其他基因中得到验证。

这个研究蛮新颖的，但是仍然有几个相关问题可能需要去回答:

1.NgAgo加了核定位信号（NLS），是否一定需要在细胞核中发挥作用？如果把核定位信号去掉，是否也能够发挥作用？是否一定需要5'磷酸化的单链DNA（5'p-gDNA），非磷酸化也会有一样的knock-down效果吗？双链DNA效果如何？

2.  利用Fabp11a对应的mRNA进行补偿实验，是否有剂量依赖关系？而NgAgo/5'p-gDNA是否能够作用Fabp11a对应的mRNA？

3.  NgAgo/5'p-gDNA似乎显示比翻译抑制工具 Morpholino（斑马鱼研究基因功能的一个工具）对基因的knock-down更有效，这个系统是否在哺乳动物细胞也一样好用呢？

4.  这个研究提示，NgAgo/5'p-gDNA可能是在转录水平起作用的，是否是直接与DNA结合起作用的？北京大学孙育杰教授利用图像工具研究，发现NgAgo/5'p-gDNA无法结合在靶基因对应的基因组位置（网络上有的），似乎与本研究的提示不一致。

美国克利夫兰医学中心从事基因转录调控研究某博后点评：作者认为是一种类似于dCas9的抑制作用。但是首先作者没有显示NgAgo有直接结合到染色体DNA上的能力。而且dCas9是要和KRAB 融合表达以后才能抑制基因转录，dCas9 本身对基因转录抑制作用比较有限。这样需要sgRNA的target 位点在TSS附近，这篇文章的2个guide RNA离转录位点有点太远了。不太可能是通过这种机制。其实做一个pol2 ChIP就知道是否是通过抑制了基因转录。

丹麦奥胡斯大学博后蔡宇伽博士点评：

双十一，刘东研究组在Cell Research发表了一篇非常吸引眼球的NgAgo文章。他们在斑马鱼中观察到了类似RNA干扰的现象，而非此前广受争议的基因敲除。这个现象其实是在意料之中，因为此前，诸多小组在重复韩春雨NgAgo的文章的时候，普遍反应可以观察到gfp基因表达下调。斑马鱼适宜的生活温度是28.5度左右，在此温度下作者没有观察到基因敲除。由于NgAgo的活性可能跟温度有关，为此，作者特意把斑马鱼胚胎放置37度，尽管此时作者依然可以观察到基因表达下调的现象，但是还是没有观察到基因敲除。NgAgo介导的基因表达下调机理现在还不清楚。有可能在转录阶段，但也有可能是在蛋白翻译阶段。如果NgAgo通过与DNA结合干扰基因表达，那么即使它不直接切割DNA也可以开发出一些有意思的工具，包括荧光定位及与FokI结合定点切割DNA。

BioArt点评：这篇文章的所有工作都是在斑马鱼中做的，而不是直接重复韩春雨NBT论文中的工作，实验结果清楚的表明gDNA/NgAgo系统能在体内特异性的一致靶基因的表达，但是不能对基因进行切割，这篇文章虽然没有在论文中直接表明是支持了还是否定了韩春雨的工作，但是实验结果清楚的告诉我们gDNA/NgAgo系统至少在斑马鱼中不能够实行基因编辑，间接的否定了NBT的结果。事实上这个结果并不奇怪，其实最早北大魏文胜教授实验室的结果也表明gDNA/NgAgo系统在293T细胞中能敲低目的基因而不能实现基因切割，笔者还询问过曾经在小鼠胚胎中注射gDNA/NgAgo的资深研究人员，他也表示在小鼠胚胎中也有类似的敲低现象发生。所以总的来说，这篇论文的报道并不代表韩春雨老师NBT的工作被证实了，后续可能还需要相关的工作去进一步解释说明，特别是解释RNAi的机制是什么，或许结构生物学能给出一些答案。

来源：生物探索、Bioart

编辑：格格

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