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离心技术哪种强?选择困难星人的福利来了

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李万杰(北京师范大学生命科学学院)
离心机是生物学教学及科研领域中的常见仪器,离心技术也是分离、制备、纯化生物样品的重要手段。沉淀离心法、差速离心法、密度梯度离心法是实验室常用的3种技术。


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离心机 Centrifuge
利用电机高速旋转产生离心力场,根据不同物质之间密度、形状、大小等方面的差异,对悬浮液中混合的不同颗粒或乳浊液中密度不同且互不相容的液体进行分离和提取的仪器设备。

沉淀离心法
适用条件
当分离悬浊液中的可溶部分和不溶性颗粒时,可使用离心机对样品进行简单、快速的离心分离,以代替耗时的过滤操作,此方法即为沉淀离心法。

沉淀离心法是从悬浊液或乳浊液中分离样品最常用的一种方法,主要用于去除溶液中悬浮的杂质,或通过离心沉淀收集悬浮于溶液中的颗粒物质。

使用方法
 沉淀离心通常使用固定的转速(即离心力),离心一定时间以达到分离的目的。
☞  沉淀离心中离心机转速转子半径离心时间是决定分离效果的主要因素。
 离心沉淀样品所需时间取决于样品的沉降系数(s值)。

Tips
☞  沉降系数
沉降系数s的物理学意义是单位离心力作用下样品的沉降速度。故沉降系数s越大,颗粒沉降越快,所需时间越短,反之亦然。

应用实例
利用沉淀离心法收集培养基中的大肠杆菌
  • 用含有相应抗生素的LB培养基振荡培养大肠杆菌过夜,将培养物转移至1.5mL离心管内。
  • 用台式固定角转子离心机12000 rpm离心1分钟,将上清液倒出,并用移液器吸取残余培养基。
  • 剩下的沉淀即为大肠杆菌
可用于小提质粒、超声破碎法粗提蛋白等实验操作。

差速离心法
原理
差速离心是根据颗粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系数)的差异,通过分级提高离心转速或高速与低速离心交替进行,使具有不同质量的颗粒样品(或大分子)从混合液中分批沉降至管底,从而实现分离目的。

适用条件
该方法适用于混合样品中各沉降系数差别较大的组分之间的分离,更准确地说是沉降系数差别在1至几个数量级的混合样品的分离,差别越大,分离效果越好

使用方法
差速离心法一般采用固定角转子,通过较低速度的离心沉淀,最重的颗粒将全部沉到管底。继续将上清液以更高的转速沉淀,即可得到次重的颗粒样品。逐步增加离心转速,即可分别得到不同重量的样品颗粒,以达到分离的目的。

通常为了得到较纯的颗粒样品,还需要将沉淀重悬,用相同的转速再次沉淀。重复几次之后即可得到大小基本均一的颗粒。

但是一般在实际使用中,差速离心通常不用于精细分离,仅用于s值相差1个数量级及以上的2种颗粒的分离,且沉淀不能实现完全回收。

应用范围
 差速离心技术的应用十分普遍,尤其是针对有生物活性物质的分离、粗提和浓缩,例如:
☞  动植物病毒
☞  各种亚细胞组分(细胞核、叶绿体、线粒体等)
☞  核酸
  蛋白质,等

应用实例
马铃薯线粒体的制备
  • 取马铃薯块茎200克,加入2.5倍体积的匀浆缓冲液,匀浆后用4层纱布过滤。滤液经4000rpm离心10分钟 ,收集上清液。
  • 上清液13800 g(相对离心力RCF,即重力加速度g的倍数)离心15分钟收集沉淀,用缓冲液重悬并加入终浓度为15mmol/L的氯化镁。
  • 经DNase I处理后,加入2倍体积的缓冲液,13800 g离心15分钟收集沉淀,即为线粒体。

密度梯度离心法
原理
密度梯度离心法是使待分离样品在密度梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,最终分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法,又称区带离心。密度梯度离心不仅可依据样品颗粒的重量及沉降系数进行分离,还可根据样品颗粒的密度、形状等特征进行分离。

使用方法
密度梯度离心在整个离心过程中只使用一种转速,中途无需变更实验参数,而差速离心则需要进行调整转速、重悬反复离心等操作。密度梯度离心适宜分离密度有一定差异的样品,而差速离心则适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分。

优点及缺点
优点
☞  分离效果好,可一次性获得较纯的样品颗粒;
 适应范围广,既可像差速离心法一样分离具有沉降系数差异的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;颗粒会悬浮在相应的位置上形成区带,而不会形成沉淀被挤压变形,故能最大限度保持样品的生物活性;样品处理量大,且可同时处理多个样品;
 对温度变化及加减速引起的扰动不敏感
缺点
☞  离心时间长
☞  需制备密度梯度介质溶液
☞  对操作者的技能要求较高

使用转子类型
密度梯度离心法通常采用:
☞  吊桶式的水平转子
☞  区带转子
☞  近垂直转子

 根据梯度介质的浓度及颗粒在其中沉降的行为,密度梯度离心又分为:
  • 速度区带离心
  • 等密度梯度离心
速度区带离心
原理
速度区带离心所采用的密度梯度为预先制备好、密度变化较为平缓的介质,且该介质的最大密度低于混合样品颗粒的最小颗粒密度。待分离样品添加在梯度介质的液面上,当样品中不同颗粒间存在沉降速度差时(不需要像差速沉降离心法所要求大的沉降系数差),在一定的离心力作用下,大小、重量不同的颗粒将各自以一定的速度沉降,离心一段时间之后(通常不超过4h),不同沉降系数的样品颗粒逐渐分开,最后在密度梯度介质中形成一系列分界清晰的不连续区带。

Tips
沉降系数越大的样品颗粒,沉降速度越快,所呈现的区带也越低,故整个离心过程必须在沉降系数最大的颗粒到达管底前结束。离心时间和离心速度的控制是速度区带离心法成功与否的关键。

适合条件
☞  有效:速度区带离心法在分离密度相差不大、重量和大小区别较大的样品(如核糖体等)时非常有效。
☞  无效:但对于大小相近而密度不同的颗粒(如线粒体、溶酶体等)则不能用此法分离。
☞  梯度介质:常用蔗糖、甘油及Ficoll(聚蔗糖)等

等密度梯度离心
原理
根据样品颗粒浮力密度的差异而加以分离的,密度差异越大,分离效果越好,而分离效果与颗粒大小和形状无关,但大小和形状决定达到平衡的速度、时间和区带宽度。

等密度梯度离心通常采用密度梯度较陡的介质,且该梯度最大密度大于样品混合颗粒中的最大密度,而最小密度低于样品的最小密度,即样品的密度范围不能超过介质的浓度梯度范围

在离心过程中,样品颗粒同时受到离心力场与浮力的共同作用而发生位移,最终二者达到平衡,即颗粒所在位置的介质密度等于其自身的浮力密度,故不同密度的颗粒会在离心管中富集成不连续的区带。当体系到达平衡状态后,样品区带的形状和位置均不再受离心时间和转速的影响。

提高转速可以缩短达到平衡的时间,离心所需时间以最小颗粒到达等密度点(即平衡点)的时间为基准,通常需十几个小时,有时甚至长达数日。

加样方法
  1. 类似于速度区带离心,即离心管中预先放置梯度介质,样品直接加在梯度液面上;
  2. 样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管,通过离心介质自发形成密度梯度。

应用范围
等密度离心通常用于分离纯化核酸、病毒、蛋白复合体、亚细胞器等,并能从组织、血液及其他体液标本中分离纯化出不同类型的细胞

 等密度梯度离心法根据不同样品的需求,梯度介质可选用碱金属盐类(如CsCI)、蔗糖、甘油及Percoll(胶体硅)等。

  • 其中CsCI最大密度可达1.7g/cm3,但由于具有较高的渗透压,通常用于核酸等大分子的纯化
  • 然而,Percoll具有渗透压低、黏度小、密度高等特点,适合分离活细胞

应用实例
密度梯度离心法制备鸡胚原始生殖细胞
取鸡胚血200 g离心5分钟,弃上清,沉淀用1 mL 8%的Nycodenz溶液重悬:
第1次密度梯度离心: 取5 mL的圆底离心,分别加入1 mL12% Nycodenz溶液,1 mL含鸡胚血液的8%Nycodenz溶液,200μL 2% Nycodenz溶液。800 g,离心20分钟;取上层溶液,1400μL,加入至800μL10%FBS-PBS中,颠倒混匀。200 g,离心5分钟,弃上清液,沉淀使用200μL8%的Nycodenz溶液重悬;
第2次密度梯度离心: 取1.5 mL离心管,分别加入600μL 14% Nycodenz溶液,300μL 10% Nycodenz溶液,200μL含细胞的8 % Nycodenz溶液,800 g,离心10分钟。取上层溶液,600μL,加至1300μL 10% FBS-PBS中,200 g,离心5分钟,弃上清液,沉淀即为原始生殖细胞,可用于后续培养、检测等实验。

文章来源:李万杰 胡康棣. 实验室常用离心技术与应用. 生物学通报. 2015, 50(4): 10-12.
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