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乳腺癌异质性的分子遗传学基础及临床应用

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李挺

北京大学第一医院病理科


　　乳腺癌在病理学、临床生物学及分子谱水平上表现高度异质性。迄今推行的乳腺癌分类及危险性评估方案，综合运用多项临床和病理因素对患者进行分类，指导临床多样化治疗方案的制定和预后评估。近数十年来，几次技术浪潮推动对肿瘤基因组突变认识的加深，尤其是高通量测序技术的诞生和应用，使对细胞全套分子改变进行系统分析成为可能，人们对肿瘤基因组突变演进、肿瘤生物学和异质性遗传学本质的认识进入全新时代。本文综述了近年来乳腺癌研究领域几类重要技术，尤其是二代测序技术的应用给乳腺癌异质性认识带来的进步。


　　关键词：乳腺肿瘤；遗传异质性；基因测定



Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2017 Feb 1;55(2):104-108.


The genetic basis and clinical application of heterogeneity of breast cancer.


Li T.


Department of Pathology, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China.


Breast cancer is comprised of a group of heterogeneous diseases that differ significantly in their clinic-pathologic characteristics and molecular profiles. For many years, this disease has been classified according to the integral clinicopathological factors, to provide a dictates for institution of therapeutic approach. Over the past decades, several waves of technology have advanced the characterization of mutations in cancer genomes, especially the emerge and application of high-through next-generation sequencing technique. It has enabled systematic characterization of the full repertoire of molecular diversity of cancer cells, and yielded substantial insights into the genomic mutation and evolution, the intrinsic genetic nature of biology and heterogeneity in human cancer. This article aims to describe recent advances and application of advanced technologies towards the identification of heterogeneity of breast cancer.


KEYWORDS: Breast neoplasms; Gene testing; Genetic heterogeneity


PMID: 28162208


DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5815.2017.02.006



　　乳腺癌，尤其是占其70%左右的浸润性导管癌是复杂的异质性疾病，在病理学、临床生物学、治疗反应，甚至分子谱等不同水平上表现出高度异质性。目前，临床应用的乳腺癌分类及危险性评估方案多种多样，通过综合运用患者年龄、肿瘤分期、组织学分类和分级、脉管浸润、激素受体及人类表皮生长因素受体2（HER2）状态等多项临床和病理学参数，将乳腺癌患者进行分类，以指导临床治疗方案制定和预后评估。


　　近数十年来，核型和杂合性丢失分析，以及芯片技术等数次技术浪潮推动了人们对肿瘤基因组突变认识的进步。尤其是高通量测序技术的诞生和应用，使对细胞全套分子改变进行系统分析成为可能，人们对肿瘤基因组突变演进、肿瘤生物学和异质性遗传学本质的认识进入全新时代。肿瘤异质性包含肿瘤间和肿瘤内异质性，前者指同一肿瘤类型不同个体的差异，涉及个体遗传背景、环境因素、肿瘤发生演进基因组改变；后者指同一肿瘤内各细胞间的差异，涉及各种内外因素作用下肿瘤细胞克隆和亚克隆发生演进的生物学特性。乳腺癌异质性的分子遗传学认识不仅能揭示其发生发展的分子动因，还可阐明不同亚型及个体间差异，为精准医疗奠定重要基础。已有大量研究着眼于基因突变和表达特征，以期探索解决乳腺癌异质性、诊断预后分层、转移的生物标志物等问题。


　　一、传统基因组分析技术对乳腺癌异质性的认识


　　比较基因组杂交及基于芯片技术的比较基因组杂交在20世纪90年代开始用于乳腺癌分子演进研究【1,2】，其结果证实乳腺癌在基因组水平上存在异质性。低级别浸润癌基因拷贝数常接近两倍体、常有16q缺失和1q获得（两条染色体间不平衡异位），而高级别浸润癌常呈明显非整倍体、更大和更复杂的拷贝数异常。上述典型低级别浸润癌基因拷贝数异常方式（16q缺失和1q获得）可见于少数高级别浸润癌，而且多为雌激素受体阳性者，提示其由低级别浸润癌进展而来，并推测乳腺癌从低级别进展为高级别的生物学现象较少见。此外，小叶癌也具有16q缺失和1q或16p获得，但涉及的16q靶基因与低级别导管癌不同。低级别导管癌至今尚未确定靶基因，而小叶癌已明确靶基因为编码E-钙黏着蛋白（钙黏素）的CDH1。E-钙黏着蛋白介导上皮细胞内同形（homophylic）与同型（homotypic）的黏附，其表达缺失导致细胞低黏附性特征，并与小叶癌侵袭和转移有关。虽有这些认识，但大量中高级别乳腺癌仍存在分子异质性。由于技术本身的局限性，上述对于乳腺癌异质性的认识并未对临床实践产生影响。


　　二、基于基因表达芯片分析技术的乳腺癌分子分型


　　基因表达谱技术可分析细胞基因表达活性及其相互关系，对调节细胞重要生物学活动的基因表达情况的综合分析可为认识肿瘤内在生物学性质提供重要信息。基因表达谱高通量芯片技术的应用在乳腺癌研究历程中具有重要意义，其揭示了肿瘤内在分子亚型并迅速转化为临床应用。2000年Perou等【3】采用包含8102个基因的cDNA芯片分析65个乳腺癌标本基因表达特征，进而筛选456个基因进行分析，将乳腺癌分为管腔（Luminal）A、管腔B、HER2过表达、基底样4个亚型。临床研究结果随即证实了这些亚型的特异性【4】。为了使基因表达谱结果实用化，人们采用简单实用的免疫组化法分析雌激素受体、孕激素受体、HER2、Ki-67的蛋白表达，进行“近似分子分型”【5】。这个方案在世界范围内获得广泛采用，但其中包含的技术因素较为粗略，而针对管腔A、B型区分的关键因素Ki-67细胞增生指数的客观评估至今仍未解决。此外，实践中基因表达谱和免疫组化结果尚存在不一致。


　　此后国际上尝试使用实时PCR结合微芯片技术基因表达分析对乳腺癌进行预后预测，目前不同国家推出了多种检测项目，多数可采用石蜡包埋组织材料。OncotypeDX从NSABPB-14临床研究250个基因中选择21个乳腺癌增生分化和复发相关基因进行分析（表1），预测雌激素受体阳性、淋巴结转移阴性患者的复发风险（低、中、高危），该项目在美国获得广泛接受【6】。MammaPrint分析涉及细胞周期、侵袭转移、血管生长和信号转导的70种关键基因，预测患者远期复发的风险（低、高危）【7】。PAM50是50基因表达谱分析，采用0～100单项数字评分预测乳腺癌10年远期复发风险【8】。GGI分析低和高级别组织学肿瘤，涉及细胞周期调节和增生等的97个基因，以增强分级精确性并改善治疗决策【9】。此外，有学者将预后差而缺乏有效治疗手段的三阴性乳腺癌基因表达谱分为两种基底样、免疫调节、间叶和间叶干细胞样、管腔雄激素受体等6个亚组，探索预后和靶向治疗方向【10】。


表1、OncotypeDX检测乳腺癌相关21个基因列表

  • 增殖相关基因：Ki-67、STK15、存活蛋白、CCNB1（周期蛋白B1）、MYBL2

  • 侵袭相关基因：MMP11（溶基质蛋白酶3）、CTSL2（组织蛋白酶L2）

  • HER2相关基因：GRB7、HER2

  • 激素相关基因：ER、PR、BCL2、SCUBE2

  • 其他肿瘤相关基因：GSTM1、CD68、BAG1

  • 参考基因：ACT（β-肌动蛋白）、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC


　　基因表达谱分析在分子表达水平揭示了乳腺癌异质性，提供了较临床和表型分类更准确的信息，并显示出其临床应用价值。但该技术本身对揭示乳腺癌异质性的内在遗传学本质存在局限性，之后的研究结果也表明，通过基因表达谱得出的分子亚型在基因异常方式上具有非常异质性。


　　三、二代测序技术对乳腺癌异质性的揭示


　　二代测序技术是测序技术的革命性进步，其技术原理多样（如大规模平行签名、纳米球等），共同点是可同时、平行地对数十万、数百万条DNA和RNA分子进行测定，并采用数理统计生物信息方法进行分析。二代测序技术的诞生不仅使所有类型突变和全套细胞基因组综合分析成为可能，并能分析肿瘤生物学相关的转录组、表观基因组等改变，从而使人类对肿瘤发生发展分子遗传学的认识进入全新时代。近10年来，大量学者采用二代测序技术分析阐释乳腺癌基因组多样性，逐渐了解到乳腺癌体细胞基因组改变全貌（genomic landscape），这些综合性基因组谱系研究并整合转录谱信息，将对患者精准分层、肿瘤生物学预测、指导制定治疗策略等产生重要影响。


　　1、乳腺癌演进过程中基因组异质性和多样性：目前人们对肿瘤发生进展的分子演进已有更深入认识【11,12】。“癌症”是由于细胞基因组异常而产生失控性生长，进而形成具有侵犯或播散性的一组疾病，其基因组异常在肿瘤演进过程中持续积累。每一例乳腺癌由大群表型异常的克隆相关细胞组成，衍生于相同正常细胞，由于突变与细胞选择这一对矛盾长期相互作用，最终演化为癌（图1）。基因组突变从宏观考虑可分为点突变（碱基替代、小型缺失和插入）和结构变化（重排和大规模拷贝数变化），突变一旦获得即不可逆，并从原初细胞传递给所有子代细胞；而不同细胞对不同突变所能承受的压力幅度不同【13】。


图1、突变和选择驱动乳腺癌进展示意图【16】


　　癌症基因组图谱和国际癌症基因组联盟等创始合作组对上千例乳腺癌外显子组进行测序，促进了对其个体肿瘤间、亚型间、个体肿瘤发展过程中基因组高度多样性和复杂性的认识【14,15】。乳腺癌在演进过程中获得了数以千计的各类型突变，在总体基因水平上，没有两个癌是完全相同的，甚至同一肿瘤不同部位，由于长时间基因组不断重塑，也有很大不同。反之又可有不同个体的肿瘤偶然发生完全相同的驱动突变【16】。


　　迄今对乳腺癌基因组突变信号的分析虽未发现明确的DNA损伤外源性致癌因素（如黑色素瘤由紫外线、吸烟相关肺癌由烟草制品引起高度特征性的点突变瘢痕），但已确定其发生过程中的突变进程范围，目前二代测序技术综合基因组分析正逐渐勾画出乳腺癌体细胞突变的综合图像【17】。全基因组测序已确定乳腺癌涉及数十个基因，其全基因组景观异常多样，单个癌常负荷数千个点突变、少数至数百个结构变化。其中PIK3CA、TP53、GATA4、MYC、CCND1、FGFR1和HER2等少数基因呈高频突变（＞10%病例），而大多数相关基因发生在个别病例（1%～3%）。在个体肿瘤内，仅少量（1～10个）突变能改变关键癌基因功能产物，即所谓司机突变（driver mutation）；而大多数突变并不改变细胞适应性，即乘客突变（passenger mutation）【18】。


　　2、乳腺癌基因表达谱亚型内的遗传异质性：癌症基因组图谱研究对825例包括管腔A和B、HER2扩增和基底样型等亚型的乳腺癌，采用从外显子组到表观遗传学等5个不同平台进行综合分析，结果表明亚型内（尤其是管腔型）存在明显分子异质性，但各型具有重要癌基因优势组合改变【19】。如PIK3CA和TP53分别与雌激素受体阳性和阴性肿瘤更相关，而雌激素受体转录程序相关基因GATA3和FOXA1多限于雌激素受体阳性肿瘤。管腔A型呈PIK3CA高水平突变（45%）、p53低水平突变（12%），GATA3、CDH1、MAP3K1和MAP2K4在超过5%病例中有突变。基底样型p53突变占明显优势（80%）并常有DNA修复相关基因RB1及BRCA1功能丢失，而PIK3CA较少突变（9%）。越来越多的研究结果在展现分子多样性的同时也预示其潜在治疗意义：对乳腺癌基因测序结果进行元分析（荟萃分析）发现，部分HER2阴性病例存在激酶和膜旁结构域活化突变，表明该基因存在扩增以外的其他活化机制，提示此类患者也可能从HER2靶向治疗中获益【20】。


　　3、乳腺癌分子分型的尝试：精准医疗的关键在于疾病分类的稳定，并与具有更少副作用和更佳临床转归的治疗效果达到最佳匹配，而肿瘤基因组异质性对此带来巨大挑战。乳腺癌国际联盟分子分类学对997例有长期随访结果的乳腺癌患者进行全基因组拷贝数和转录谱分析，整合聚类为10组具有特征候选驱动基因和临床转归的综合亚群，并在另995例病例中证实其可重复性【21】。之后其他小组采用元分析（荟萃分析）通过随访在更大病例组（7500例）证实其稳定性【22】。这些尝试的临床应用有待积累认识和技术实用化。


　　4、乳腺癌肿瘤内基因组异质性：除了对大块组织描述综合性基因谱之外，单细胞或小群细胞分析技术的进步使人们认识到肿瘤内存在广泛基因组异质性，即异质性存在于原发灶、治疗过程中和转移病变等不同时间和空间中【23】。如前所述，一个肿瘤中的癌细胞因克隆相关性而具有部分共同突变，但在肿瘤发展进程中，癌细胞暴露于各种压力（如肿瘤微环境和医源性处理）而不断获得不同改变，可发生进一步的驱动突变使相关细胞及其后代获得生存优势。这种选择和突变联合作用，使癌细胞基因组异常在肿瘤演进过程中逐渐积累，导致肿瘤内不仅存在主克隆，也存在亚克隆的多样性和异质性。肿瘤从一种疾病状态进展到另一种，如原位癌到浸润癌、局部到转移、治疗反应到耐药，反映了肿瘤生物学基础的变化，实时获取具有代表性的生物材料成为精准医疗的关键。但系列性获取实体标本存在困难，并可能由于异质性而具有偏差。


　　四、基于液体活检的乳腺癌肿瘤内基因组异质性分析


　　近年来，循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）分析，即不损坏组织的所谓非侵袭性液体活检技术，为疾病过程中实时分析评估肿瘤分子谱、监测治疗效应带来崭新思路。CTC和ctDNA的基因组突变方式反映了体内肿瘤基本情况【24】。CTC可从原发肿瘤或转移灶脱落进入外周血，单个或小簇状存在于外周血中，其中包含具有播种和再播种转移、甚至致死能力的所谓“罪犯细胞（culprit cells）”亚克隆群，其水平与患者生存和治疗反应具有相关性，CTC计数不仅能评估疾病负荷和发现残留病变，并可根据“罪犯细胞”特征为靶向治疗提供依据。cell-freeDNA片段在亚临床阶段即可由于细胞凋亡坏死而脱落进入血液，构成疾病异质性代表的DNA池，并与疾病分期和预后相关。新近研究结果证明了ctDNA谱分析在检测乳腺癌转移、监测治疗反应和耐药亚克隆出现中的可行性，展现出在乳腺癌动态发现和监测方面的前景。


　　CTC和ctDNA均为非侵袭性技术，能确定肿瘤演进中基因组时空变异和共存的多种分子改变。两种技术具互补性：CTC能进行蛋白表达和体外细胞培养功能分析；而ctDNA为直接DNA大分子，单位体积中含更多基因组当量，灵敏度更高。ctDNA对于直接监测疾病负荷和限定分子谱更有用，但一旦发现疾病负荷增加，通过已知癌细胞CTC进行肿瘤DNA、RNA甚至蛋白水平的综合特征分析，将更有助于进行理想的治疗选择。乳腺癌基因组变化方式多样，目前尚未确定特异性监测标志。而在体液中定量检测HER2分子扩增在技术上还有难度，因此，寻找广谱而特异的基因标志是探索的热点。目前认为，转移乳腺癌患者外周血CTC的存在和数量是独立预后因素。


　　可以预测，所谓“组学”时代革命性技术的应用对乳腺癌基因组学全面认识的积累将阐明其发生演进的分子通路，从而展现异常癌源驱动基因及基因组驱动亚型、候选生物标志物等。这些研究成果将逐渐整合到临床应用中，促进乳腺癌领域进入真正的精准医疗范畴（图2）。技术方面也将向更加实用的方向发展，高效技术的应用将降低既往多基因分析的高昂成本，对个体化医疗提供精准的诊断治疗指导。同时与其他肿瘤诊疗领域一样，病理学将迎接乳腺癌精准医疗带来的巨大挑战。


图2、新技术展现乳腺癌临床相关的

      未来方向和视野图示【16】


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原文参见：中华外科杂志. 2017;55(2):104-108.







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