怎样做好造血细胞CFU集落检测？

集落形成细胞（Colony-Forming Cell，CFC）检测，也称为集落形成单位（Colony-Forming Unit，CFU）检测，是目前体外检测造血干/祖细胞功能的“金标准”。CFU检测通常是将造血细胞以一定的密度接种于添加了适当细胞因子的半固体培养基中，如甲基纤维素培养基MethoCult™，造血祖细胞在培养期间会增殖和分化，生成成熟的血细胞集落；依据细胞集落的数量和种类（后者以形态学和细胞表型为标准来判断）鉴别分析造血细胞的功能和质量。CFU集落一般分为：红系细胞集落形成单位（CFU-E）、爆式红细胞集落形成单位（BFU-E）、粒细胞集落形成单位（CFU-G）、巨噬细胞集落形成单位(CFU-M)、粒细胞/巨噬 (CFU-GM)和混合细胞系集落形成单位（CFU-GEMM）。

在CFU集落检测中，重点需要考虑两点。一是使用的培养基可使造血细胞及其集落内的子代细胞最大限度地生长和分化。二是培养基内的基质，必须能增加培养基的粘性，但还不能将培养基变成固体。因此使用半固体培养基是关键，因为半固体培养基可使单个祖细胞的子代限制在固定位置形成集落，这样可对不同的集落形态进行鉴定和计数。

甲基纤维素半固体培养基（MethoCult™）是进行这些检测的标准化培养基，因为与其它类型的半固体支持系统（琼脂）相比，在低温条件下，甲基纤维素的粘稠度更容易控制，加入的细胞因子活性更稳定，更适合于集落的形成和生长。在使用甲基纤维素半固体培养基过程中，需要注意很多技术细节，在此我们对部分细节问题进行了汇总。如此文对您有所帮助，期待您动动手指将其转发，以便更多的人能受益。

造血干细胞CFU集落检测流程：

（一）准备MethoCult（甲基纤维素半固体）培养基

1．解冻：MethoCult培养基在室温（15-25℃）解冻或者2-8℃条件下过夜解冻。请不要在37℃ 下解冻培养基。冷冻的 MethoCult™（甲基纤维素）半固体培养基是不均匀的，如果在37℃ 下快速解冻，可能出现固体状物质。如果产品不小心在37℃ 下解冻，请将培养基置于冰上1-2小时或放入4℃冰箱中2-3小时（37℃条件下，固体状物质不会溶解）。在分装之前，用力摇晃培养基瓶1-2分钟，使其混合均匀后，4℃静置15-30分钟使气泡上升至顶部。

2．分装：使用3 mL螺口注射器（#28230）和16号钝针头（#28110）将培养基分装到14 mL无菌试管（#352057）。对于1.1 mL培养体系两孔重复培养，每管分装3.0 mL；对于1.1 mL培养体系三孔重复培养，每管分装4.0 mL。请采用螺口注射器（#28230），以避免在推压柱塞的时候针头脱落。用钝针头（#28110）分装黏性的培养基更加精准，而且可防止针头扎伤。

注：由于MethoCult™培养基在室温下黏度较高，因此可将分装好的培养基至于2-8℃条件下，去除试管中的“气泡”，然后再-20℃条件下冻存。

（二）制备细胞

1．细胞样本的收集：用含有肝素钠盐（#07980）的无菌试管收集血液样本，避免凝血。

注：如果采用的是EDTA(乙二胺四乙酸)和ACD(柠檬酸葡萄糖)收集，需要在稀释和清洗过程中向培养基中加入额外的抗凝剂。

2．红细胞去除：用氯化铵（红细胞裂解液）（#07850）、Hetasep（#07906）、SepMate（#15415）免疫密度梯度离心去除红细胞。

注：如果是冻存的血液样本，复苏后红细胞已裂解，不能利用Hetasep去除红细胞。

3．细胞洗涤：用含2% FBS的IMDM（#07700）清洗细胞，并调整细胞浓度。

注：对于无血清培养条件，用含25 mm HEPES的IMDM（#36150）洗涤。

4．细胞计数：用含3%乙酸的亚甲基蓝（#07060）对有核细胞进行计数或用台盘蓝（#07050）排除法计数活细胞，确定细胞浓度。。

注：细胞在加入亚甲基蓝10分钟内对细胞进行计数；如果是台盘蓝计数，则细胞在台盼蓝中的孵育时间不宜超过15分钟，否则可能会引起细胞死亡，导致计数不准。

5．细胞浓度：将通过细胞计数确定的细胞浓度用含2% FBS的IMDM（#07700）或者含25 mm HEPES的IMDM（#36150）稀释至10倍的接种浓度。（以35 mm培养皿为例：每个35 mm培养皿接种0.1 mL细胞悬液，如果想达到接种细胞的数量为1 x 10e4，需制备1 x 10e5细胞/mL的细胞浓度。）

注：该35 mm培养皿（#27100）经过预测试，可优化集落生长，而不支持贴壁细胞的生长。

（三）细胞接种和培养

1．将细胞加入分装好的MethoCult（甲基纤维素）半固体培养基中涡旋、震荡。

注：涡旋5分钟后，4℃静置15-30分钟，使气泡上升到顶部，立即将混匀的细胞接种到培养皿（#27100）或Smartdish 6孔培养板的（#27301）中。

2．接种密度：将合适的细胞量接种在35 mm培养皿或者SmartDish 6孔板中。如果细胞接种不足，可能导致集落太少，造成计数没有统计学意义或统计数据不准确；如果接种密度过高，会导致培养物中营养过渡消耗，细胞代谢产物积累，抑制祖细胞的增殖，并且由于集落太多将造成细胞集落重叠，使得无法准确计数集落。根据不同的组织细胞来源和不同的细胞样本处理方法，推荐的接种密度见下表： 

注：BM:骨髓；BM MNCs：骨髓单个核细胞；BM MNCs：脐血单个核细胞；PB MC：外周血单个核细胞；MPB MNCs：动员外周血单个核细胞。通过使用LymphoprepTM(#07851)和sepmate(#15415)获得MNCs。

*：细胞悬液的浓度范围。#：仅限于含有细胞因子的完全培养基中的接种密度范围，如果是不含细胞因子的培养基，接种密度为表格中的1.5-2.5倍。

3．细胞接种：对于1.1 mL培养体系两孔重复培养，将0.3 mL 调整好浓度的细胞悬液加入预分装了3.0 mL MethoCult™的试管中。对于1.1 mL培养体系三孔重复培养，将0.4 mL 稀释细胞加入预分装了4.0 mL MethoCult™的试管中。该1:10（体积比）的细胞：培养基比例具有适当的黏度，可确保最佳CFU 生长和形态。

4．细胞培养条件：将接种细胞的35 mm培养皿（#27100）和一个无盖的35 mm培养皿（内有3 mL无菌水）放入245 mm（#27140）带盖的方形培养皿中。如果用的是SmartDish（#27301），则在SmartDish各孔之间的槽内加入4 mL无菌水和4个无盖的35 mm培养皿（内有3 mL无菌水）一起放入245 mm方形培养皿（#27140）中。使用带盖的方形培养皿有助于在培养过程中保持湿度，防止培养基变干，同时也能减少污染。也可在含水的培养皿中加入添加物（如：硫酸铜晶体），防止微生物滋生。

（四）集落计数

1．37℃、含5%CO2、湿度≥95%条件下，培养14天左右，可对CFU集落进行检测，每次只取出1小时内能够计数完毕的培养皿数量。

注：所用的倒置显微镜应配备低倍（2X或2.5X）和高倍物镜（4 - 5X，10X），10X或12.5X目镜，以及蓝色滤光镜，以增强血红蛋白化的红系细胞所显示的红色。

2． 如果细胞是培养在SmartDish 6孔板（#27301）中，进行细胞计数可配合STEMgrid-6计数网格(#27000)进行。该计数网格专门用于对SmartDish 6孔板中的集落进行计数，也可与标准35 mm培养皿（#27100）配合使用。

注：计数时建议从上向下一个方格一个方格计数，而不是从左到右，有助于减轻计数人员的眩晕感。

3．计数时，拿放培养皿时小心轻放，保持培养皿平移，避免培养皿倾斜引起集落形态发生变化。

正如上文所说，甲基纤维素半固体培养基（MethoCult）中添加了不同细胞因子组合后，造血祖细胞可分化成不同的集落形态，通过对不同形态集落的观察，确定各种集落的数量。北京诺为技术有限公司提供的完全培养基，非常便利，只需加入细胞、混匀、接种和培养，便能实现您对集落的检测。而针对做体外药物毒性检测、造血细胞功能检测、细胞因子作用研究等的科研人员，我们还提供不完全培养基，您可以根据自己的研究添加相应的细胞因子。

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