【听课笔记】结核分枝杆菌是否确实对牛保持沉默——郭爱珍教授

主持人：下一步报告嘉宾来自华东农业大学郭爱珍教授。郭教授是大家都熟悉的国内教授，这里面我就不详细做介绍了，请郭教授做报告。

郭爱珍：

    感谢会议组委会给我这么好的机会，感谢我们沈鑫博士前面做了很精彩的报告，为我报告做了基础。今天我们沈博士因为是在动物圈里面，以前在我们人的圈子里面去，我想我们人的结合有我们动物结合其中一部分，专家们就说你们站开一点，我们人类结核病已经非常头疼了，我想谈动物结核病。我准备从这几个方面给大家做介绍，前面沈博士已经讲很多了，结核病对于全人类来说都是非常严峻的问题，尽管说它的发病几率，它的死亡率是十万分之几，但是因为人口基数太多，感染基数太大。每年新增900万新发病例，病死灾难每年要增加200万人，所以人类必须引起重视的。还有一个问题结核病，结核分枝杆菌，我们知道病原微生物和数种是共同进化的过程，结核分枝杆菌是非常规型病原杆菌。世界上只有5%-10%的感染者才可以发展成为临床型结核病，正因为如此所以到现在为止没有没有特别好的方法，可以说是一个老病，而且用老手段控制。大家可以看到结核分枝杆菌从发现到现在有134年了，结核病的疫苗我们动物没有疫苗，人的唯一的疫苗就是卡介苗，而且只对儿童有效，也已经有95年了。在小动物，在老鼠、兔子、猴子做出来觉得比卡介苗好一点，再往上做就觉得没有哪个苗超过卡介苗。这个药物是利福平是1965年上市，现在有一些药物，但是没有根本改变情况。结核菌素皮试检测也是有126年了，这是与它的特征有关系。对于结核分枝杆菌来说，它是一个群，群肯定不止一个成员。但是这个成员之间只有一个祖先，它是一个祖先发展来的，这个当然不一定准确，是2万年之前或者3万5千年之前，不管怎么样是由老祖先中来的。它同源之间的多样性只有0.05%的差异，各个成员之间虽然说遗传基础真的这么接近，但是它又表现出来宿主嗜性的差异，它们之间又有明显宿主的倾向，都是以结核为主要特征，下面有一颗一颗的，像女同志项链一样的，一颗一颗的。这些结核早期是化脓性的，后面就变成病症。这些结核病人80%在发展中国家，但是历史上不是这样，这是目前的情况。刚才沈博士说我们中国已经是第三位了，原来是印度第一，中国第二。

         那么来自于同一个祖先，基因组差异很小，只有0.05%的差异，而且基因是不断在减少，所以到后面牛分枝杆菌的基因和结合分枝杆菌，它没有新的基因，它是越来越少，不断减少。不断减少数组之间出现了差异，大家可以看到基因组的变化。你看这是它的祖先不断减少，减少的结果就是说它的数种化不断改变，前面都是对人影响最强，他们之间又有一些差异，主要是非洲的人群。所以这个分枝杆菌主要感染动物，这些感染羚羊、这是感染田鼠，这是感染羊，这是感染牛。
下边我们判断牛分枝杆菌对于人的致病性，实际上是最早被认可的。早在19世纪初期，人的结核病是非常厉害了，刚才讲利福平，治疗结核病的药物，第一个问世是1965年，大家知道结核病是消耗病。想到第一策略是增加影响，提高自身抵抗力。提高自身抵抗力最好的方式是喝牛奶，但是那时候牛奶还没有发现巴氏消毒，人喝牛奶为了控制肺结核。结果就是通过喝牛奶反而使得结核病增加了，据不完全统计在英国因为直接喝没有消毒的牛奶，导致人结核病死亡因为牛引起的，其他国家也是一样。据世界统计平均3.1%的人结核由牛分枝杆菌引起的，发达国家10-30%由牛结核分枝杆菌引起的，因为大城市引用巴氏消毒奶只有1%人的结核。看一下英国当时的情况，英国30年代的情况，屠宰场明显有结核结节的牛是40%，91%的淋巴结核，5岁以内28%的脑结核由牛分枝杆菌引起的。实际上英国技术很先进，1911年意识到这个问题，喝牛奶导致人结核。当时国家组建了结核病调查小组，确认到底牛结核能不能引起人结核。当时下了结论，牛结核确实导致人结核，这种情况下按照道理应该采取措施控制牛结核。但是因为Robert Koch他认为牛结核不能导致人结核，因为权威专家在这儿，导致冤枉死掉很多人。1911年英国得出这个结论，美国1917年开始全国性进行牛结核控制计划，他们很快把牛结核占人结核比例控制下来，而且牛结核比例也下来了。

         一般说来发展中国家，基本上引用这个数据，10%-15%的人均由牛分枝杆菌引起的，但是不同的国家不一样。尼日利亚是3.9%，埃塞俄比亚就比较多，是10.8%颈部淋巴结核他们认为是牛结核引起，苏丹是7.4%，我们国家有的达到10%以上。那么牛结核对于人来说感染性是确定的，第二问题是牛结核为什么会在人结核当中传播？但是不是这样，它是可以在人当中传播。比如说这个例子，一个男性肺结核病人，感染之后很快节得了牛结核。他得完结核之后追踪到这个人接触史，追踪到他到教堂做义工的时候，另外一名女士得了肺结核，分子鉴定认为这两个人一样，除了这个人181人有39人处于潜伏感染期。那么牛分枝杆菌，一个观点它感染人但是它不传播，另外越来越多例子表明，它在一定条件下可以传播。到底什么条件下导致牛分枝杆菌在人当中可以传播？有一个观点认为，如果牛分枝杆菌失去了感染人的能力或者变弱，原因是双组分系统发生突变，导致毒力改变，在人间传播能力丧失。另外一个方面，从基因进化和重组的一些从人分到牛结核菌株的特征，发现一个问题，PhoPR实际上它可以广泛调节基因的系统，是它发生了改变之了人间传播能力的丧失。进一步研究发现，如果把这几个，实际上需要三个点突变，把这三个点突变回来，或者在PhoPR插入，可完全逆转牛分枝杆菌的传播能力。这也是一个比较新的文章，2014年PNS的文章。这个文章做的很漂亮，通过这个做完之后，可以把结论得出来了，基因组关键的突变，可以使牛分枝杆菌的传播能力增强。

         第二部分，关于结核分枝杆菌对牛的致病性，传统的观点认为，前面这个观点过去了，一般认为内分枝杆菌对对人，牛结核对人是治病的，近期观点认为不但是治病而且是传播，这个观点进一步改善是有很大意义。另外一方面，长期以来人一直认为，结核分枝杆菌对牛群的流行率通常小于1%，只有和肺结核病人，他可能感染了结核分枝杆菌，这种感染是异波性，不会导致结核。近年来从流行病学证据可以看出来，越来越多的结核分歧杆菌，在牛群里面分出来，国内外都有。总体说来流行率同长小于1%，因为大家都知道结核分枝杆菌它是怕湿热，一消毒之后细菌就死掉了。但是有一些特殊的地区报道了，阿尔巴尼亚达到6.2%，苏丹7.4%。埃塞俄比亚两个报道很有意思，一个报道是这样如果农场主得了肺结核，牛得肺结核比没得过肺结核的农场比例要高。这里分理处11株结核分枝杆菌，按照比例来说结核分枝杆菌占了18%，还是有很大的比例，虽然牛结核占主要。同这个也可以看出这个是传播，后面我们还有证据。埃塞俄比亚还有一个是人传染给牛这些这么一个环节，当然这个环节没有证明，是不是这样就把结核传递过来了，但是确实有别的地方没有过的举动，他放着牛没什么事，他就直接吐了，就喂给牛了。因为有一个比较研究，他集约化养殖，基本上是牛结核分枝杆菌，只有少部分是内部结核分枝杆菌。还有印度2005年的报道，非常直接证实了这个问题，这个农场主得了肺结核，他也养了牛，这个牛陆陆续续得了结核，他普查了几头牛，对人结核和结核分枝杆菌做了基因型。大家看看这个是工人，农场主的细菌带型，这个是牛结核分枝杆菌带型，他们是不是一模一样，就表示它的来源是一样。所以这个是第一篇，有直接的证据证明人的肺结核，而且人类得肺结核，这是一个证据。

         那么中国的情况是什么样，我们一直开展这方面的研究，从“十一五”到“十二五”，我们从牛里面分了很多结核分歧杆菌，我们这个叫spoligotype从而检测重复序列，得到了这个图。这个是结合分枝杆菌典型基因型图谱，前面都没有只有这边有。北京型是什么概念？我们国家里面北京型占了80%以上，就是我们国家结核分枝杆菌优势就是北京型。
我们分到我们国家优势基因型，我们同时把当地结核病医院，病人结合分枝杆菌做了VNTER给进一步，最后证明牛分到结合分枝杆菌和人结核优势是一样的。所以结论牛里面的结合分枝杆菌是来自于人的。第二个实验是把不同的菌株进一步做分型，发现他们是同一个型。通过这两个菌株我们证明，结合分枝杆菌因为我们自己都杀牛然后再分菌，我确确实实知道。知道结合分枝杆菌可以感染牛，而且可以在牛之间进行传播。

        刚刚讲的都是从流行病学角度和分子流行病毒角度，下面我再给大家交流一下试验的证据。第一个实验是罗伯特·柯赫，他使得欧洲出现了很大的误差。他的理由是，他做过感染实验。他用了几个途径，用结核病人的痰液感染牛，字持续8个月持续喂服，皮下与腹腔注射，几个月下来没有看到具体的症状，把牛杀之后也没有看到变化，最后发现人结核对牛无毒力，既不感染也不发病。那么痰液里面到底多少菌是不清楚，最后这个病例也是有问题的，有没有临床症状，有没有病理变化，有没有做检测，结核分枝杆菌是以持续性感染为特征的，自然感染特征下面，只有5-10%感染者发展成为开放性结合。所以你问这几头牛，接下面有临床症状，或者成功的感染这也是很为难的事情这也是他做的实验。从不断报道之后，，再做实验要证明牛结核能不能对人治病。是用气管内注射，一定剂量的结核分枝杆菌，观察17周，在大部分感染牛导致了潜伏感染，成功引起了细胞和体液免疫，但未产生病理学变化。说明他又用特异性这两个蛋白，也做了反应，说明细胞免疫反应确实上去了。17周结束之后，他把这些牛铺杀，这些感染的牛，体内又分为结核分枝杆菌，确实已经完成了循环，这个菌已经分到了，说明他建立了感染。但是当然同样没有产生病理变化，和前面不一样，前面既不感染不发病，这个实验也在埃塞俄比亚做的。我当时和他讨论，我说你现在下这个结论不见得正确，你这17周没有病理变化，你就认为不治病，对于持续性感染的疾病，这个下结论还是早了一点，他说确实，我们有条件还是要做一下。

         第三个实验是我们自己做，我们也是做到结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌的代表株和我们从牛体内分到，三个菌株感染了33周，8个月，完了之后我们从部分牛分到结核分枝杆菌，但是还是同样没有变化。和英国人做不同的是，英国牛有结合分枝杆菌，我们的牛没有。他和我们不同是，他的做之前做了同属，证明它病理变化很典型，由于结核分枝杆菌是另外一回事。我们因为拉的也是牛分枝杆菌都没有这一步，因为是牛分枝杆菌有，结核分枝杆菌没有，所以他认为没有，有可能病程不一样。细胞免疫包括皮试，但是没有典型病变，我典型可以判断消耗性变化，比如说我结核感染你皮下脂肪几乎没有了，肾下脂肪也几乎没有了。从组织切变可以看出有消耗性变化，但是没有典型结核病的症状。后来实在没有变法做核磁共振，看到血清代谢组学有没有变化，这里有结核病代表株和我们流行株。他们代谢组学是一样，都表现了代谢障碍，就是能量消耗了，脂肪这些代谢产物增加等等，这些同样的变化。因为它可以建立持续感染，而且确实有致病性。当然我们也是想再做一遍，这么长时间成本非常高，40头牛做了八个月，因为在特殊情况下，成本特别高。所以我们就没有往下做。

         下面还有一些分子跨种感染分子证据，这个证据前面已经涉及到了一些，因为前面讲到了牛分子杆菌，可以在人分支杆菌传播，报道的比较少，主要引用牛奶，肺外结合，接触距离比较近等等。大家看到结合分枝杆菌是来自于一个老祖先，这里面分出来一个非洲结核分枝杆菌，它主要感染非洲人群，主要局限在西非的人群，它的动物源结合分枝杆菌就非常接近，它有一个共同基因组的特点，一个是GGT到ATT，这三个SNP大家推测一下应该就是牛分枝杆菌对于人结核分枝杆菌对人的感染率和人间传播降低一个基本的遗传背景。那么这篇文章的实验。它就是这样做，它把他们的突变，插入上游插入IS6110，就得到了猜测，突变都发生改变，结核分枝杆菌有了突变之后，它在人的传播率用增加了，用它的话说就是逆转了。这个实际上非洲结核分枝杆菌，它的毒力也降低了，所以说它有点动物的捷径。大家看一下这是我们的证据。

    我们做了人工感染实验，把流行猪感染之后，从各个角度证明确实感染了，而且能够导致免疫力，造成体内异常，我们也做了基因组策划，我们牛源人学猪了北京型是最同源，进化这么多年几万年下来，和它的老祖先也是99.99%的同源性。它也有一些特殊的地方，前面这篇证明了突变，这些特定的变化和IS6110年的插入导致独立和转播能力的变化。我们也发现了这个变化，你看我们IS6110年都是在上游插入，都包括了Phop还有这些重要的基因，也包括突变。所以从基因组痕迹来说，我们觉得它确实也是有一些基因的特征，让它在牛间传播，感染病和传播。

         整体得出的就是，这个结论大家都认可，整体说来它是人兽共患病原体，我们总是说动物感染人很小心去提动物感染动物的事情，他们有相对的物种的倾向，一定条件下，牛分枝杆菌确实可以感染人，而且可以在动物之间进行传播。感染牛之后它也可以在牛间传播。退一万步说，就说结核分枝杆菌感染牛，继续做，但是结核分枝杆菌感染牛，那么这有几类同时有两种菌，一种是结核分枝杆菌，一种是牛结核分枝杆菌，他们可以建立感染，可以维持菌这么长时间，它对人的威胁远远高于原来感染牛分枝杆菌的这种概念。因为结核分枝杆菌总体说来，肯定是对人的独立相对来说还是强一些，所以说这个结论和这些现象，对于以后无论是人结核控制措施还是牛结核的控制措施都有很大的意义，就像我们一直在说一个健康，一个医学一样，当成一回事，当成同一个高度重视它，来对待它。

         感谢大家的聆听！

主持人：感谢郭教授给我们分享的一些数据，以及郭教授非常有价值的观念，各位有什么问题？

张启敬：郭教授我问一个问题您刚才讲牛的分枝杆菌尤其牛的结核，我们国家现在在人的结核里面占多少比例？第二个问题如果牛分枝杆菌在牛里面持续存在，而且有亚临床反应，产生病理变化的话，将来对防控造成很大的障碍。想从根除方面是不是不好办？

郭爱珍：至于牛分枝杆菌在人当中的比例分不同的地域，大城市因为普遍引用巴氏消毒奶只有1%左右，对于偏远地区没有引用巴氏消毒奶的地区，和牛混居，这种情况情况相对比较高，有报道6%也有10%。第二关于牛分枝杆菌在人或者结核分枝杆菌在牛持续感染确实是一个问题，目前情况下我们引用了一个错误，比如说养殖这要进行健康检查，不能是结核病人，实际上我们人畜共患的病人，从法律上来说不应该让他们饲养动物。第二，就是检测，从检测上来说，实际上我们没有必要分人结构还是牛结构，皮试反应牛结核和人结核，淘汰还是一个根本的措施。现在唯一的困难，一个是牛群的移动，因为现在都有快速移动的过程，牛群的检查，存在一些成本还是依靠皮试。在农场检疫，这块还是很大的漏洞。另外政府的补偿额度和市场价格差的太远，导致养殖者和地方政府差的很大，这是我们控制计划有效实施的很大原因，从技术程度来说，检疫和捕杀是很大的办法。