基础篇 | 如何正确解读Sanger法测序结果？

质粒或PCR产物测序结果成功的彩峰图里，单峰清晰干净（受仪器限制，最前端20-40bp峰不规则）。

质粒测序有效片段可达800bp（800bp之后可能出现部分宽峰）。

PCR产物测序结果可看到最后一个碱基为A（高保真酶除外）。

正常测序结果示例

现象：彩峰图中，前面清晰干净；后面出现双峰，信号强度比左边低。

原因：挑克隆时两个不同菌落混在一起。

策略：重新挑单克隆，重新提取质粒。

部分重叠峰示例

现象：彩峰图中，每个单峰下面都有其它染料颜色。

原因：PCR主带与杂带混在一起。

策略：回收主带连接T载体测序。

单峰不干净示例

4

特殊结构-高GC

现象：峰图提前终止，序列不能完整读取。

原因：序列有特殊结构或高GC，影响序列的正常延伸。

策略：制备高纯度的DNA，或提前与测序平台老师沟通，设计特殊测序方案。

正常测序提前终止示例

改善后的测序结果示例

现象：测序峰逐渐变宽。

原因：测序样品进入毛细管太多，可能是样品浓度太高，或样品不纯净，影响序列的正常延伸。

策略：稀释样品，重新测序。

宽峰峰图

现象：序列峰图从第一个碱基开始一直到测序结束，测序峰都不是单一峰型。

原因：测序的模板可能不止一个；接菌可能受污染；通用引物和载体并非特异结合。

策略：重新测序重新挑取单克隆。如果样品本身不存在问题，可能是引物和模板不止一个结合位点，可尝试另外的引物进行测序。

重叠峰图

现象：序列峰图基线杂乱，可看到四色的染料峰，没有明显的信号。

原因：引物不能与模板特异性结合，测序反应无法进行，剩下过量的BigDye染料。

策略：重新设计引物。

引物不与模板特异结合示例

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无信号

现象：序列峰图杂乱无章，测序干扰较大，没有明显主峰。

原因：测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。

策略：重新制备模板，请提供正确的载体信息和引物信息。

测序失败示例

北大生科院仪器中心

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